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A型副鸡嗜血杆菌(山东株)的分离与鉴定
杨国良,郑杰,张发明,孙丰廷,张洪,张红,邓秋红,王文泉
 
摘要:2011年11月,山东某肉鸡场发生以肉鸡眼睑及眶下窦周围明显肿胀为主要特征的传染性疾病。从采集的发病鸡眶下窦中分离到1株细菌,根据发病鸡群的临床症状、细菌的分离培养、形态观察、过氧化氢酶试验、革兰氏染色、动物回归试验、免疫攻毒试验和PCR等方法初步鉴定为副鸡嗜血杆菌(Hpg)。此外通过分离菌株的水平传播试验结果表明,造成该鸡场Hpg的水平传播和鸡传染性鼻炎的反复发作与饲养密度有很大的关系。最后将分离菌株送匈牙利诗华研发中心进行分型鉴定,确定为A型副鸡嗜血杆菌。根据分离地点将分离菌株命名为A型副鸡嗜血杆菌(山东株)。另外通过与GenBank已发表的Hpg基因序列进行同源性比对分析,结果显示,该基因序列与参考株的基因核苷酸序列同源性达99.0%。
 
鸡传染性鼻炎(infectious coryza,IC)是由副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum,Hpg)引起鸡的一种急性呼吸道疾病,本病主要引起育成鸡生长发育不良和产蛋鸡产蛋明显下降(可引起产蛋率下降10%~40%)(Calnek等,1997)。鸡传染性鼻炎主要经水平传播,不经蛋传播。鸡是副鸡嗜血杆菌的自然宿主,任何年龄的鸡都易感(Yamamoto,1991),但幼鸡一般不太严重,成年鸡潜伏期缩短,病程延长。此病在秋季和冬季最常见,这种季节性分布可能与饲养管理是一种巧合(如存在IC的鸡场引进易感的后备鸡)。在不同日龄鸡群混养的鸡场,鸡从育雏舍移到感染鸡群附近的育成舍时,通常1~6 周后将会发生该病向相继年龄群的传播(Clark等,1961)。按照Page的凝集试验分型方案,副鸡嗜血杆菌可分为A、B、C 3个血清型,各型之间不产生交叉保护(卡尔尼克,1999)。一种血清型制备的菌苗免疫鸡只能对同源菌的攻击提供保护。鸡传染性鼻炎存在于世界各地,目前,中国流行的副鸡嗜血杆菌的血清型主要以A 型为主(冯文达,1987;Chen等,1993;张培君等,2001),Page B型Hpg引起的IC也有报道(Zhang等,2003),这就要求现阶段养殖户在免疫时有必要将IC疫苗与目标鸡群中存在的血清型相匹配,这样才能达到最理想的免疫效果。本研究的主要目的是通过对A型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及免疫攻毒试验,验证现阶段该鸡场所分离到的A型副鸡嗜血杆菌菌株是否发生变异,毒力是否增强及用现有的疫苗是否能够做到免疫保护,从而为本病的预防和控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 标准菌株   C-Hpg-8(Page A 型)由中国兽医药品监察所提供。
1.2 鼻炎疫苗 鸡传染性鼻炎(A型)灭活疫苗由北京华都诗华生物制品有限公司提供。
1.3 主要试剂 DL2000DNA Marker、DNA聚合酶、dNTPs均购自TaKaRa公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.4 培养基 鸡肉汤培养基、鸡肉汤琼脂、半合成培养基参照冯文达(1987)介绍的方法制备。
1.5 病料信息 2011年11月,山东某鸡场暴发以眼睑及其眶下窦周围明显肿胀、鼻孔有黏液流出,精神沉郁、缩头、呆立,食欲减退为主要特征的传染病,7d内蔓延全群,有90%的鸡出现症状,经初步判断为鸡传染性鼻炎的临床症状。
1.6 细菌分离 将临床症状比较典型的病鸡处死,取头消毒,无菌切开眶下窦,用接种环蘸取眶下窦内容物,在含有NAD(辅酶Ⅰ、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的鸡血清琼脂平板上划线,同时接种普通肉汤和普通琼脂平板作为对照,然后将平板翻转放于37℃、5%CO2培养箱内培养16~20h,挑取单个可疑菌落进行纯培养,同时将纯培养物作为研究对象,开展相关实验室研究。
1.7 过氧化氢酶试验 挑取典型的菌落进行过氧化氢酶试验,如有气泡产生即为阳性反应。
1.8 无菌检验 将可疑细菌的纯培养物接种酪胨琼脂(GA)斜面及葡萄糖蛋白胨(GP)、硫乙醇酸盐(TG)小管各2支,每支0.2mL,1支置37℃培养,1支置25℃培养,观察3~5d。
1.9 种子液活菌计数方法 采用微量点板计数法。选择适宜的4个稀释度,每个稀释度接种2点,接种量为10μL,接种鸡肉汤琼脂使其自然扩散。于
37℃、5%CO2培养箱培养20h。依照GB4789.2-94中的方法开展活菌计数。
1.10 引物合成 根据陈小玲等(1996)介绍的已知引物序列,由Invitrogen北京分公司合成。上游引物P1:5′-CAATGTCGATCCTGGTACAATGAG-3′;下游引物P2:5′-CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT-3′。
1.11 PCR鉴定方法 按常规方法处理细菌培养物,将上述培养物取2μL作模板进行PCR。PCR程序:98℃预变性2.5min;94℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸2min,循环25次;94℃ 变性1min,65℃退火1min,72℃延伸10min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析(Chen等,1996)。
1.12 回归试验 取新鲜的细菌培养物(对数生长期细菌)经活菌计数,且将其稀释后眶下窦内接种70日龄SPF鸡,其中试验组和对照组分2个隔离器饲养,接种后逐日观察其临床表现。试验情况见表1。

1.13 免疫攻毒试验 取60~90日龄SPF鸡12只,其中免疫组、对照组在分别接种疫苗、PBS 30d后均眶下窦内注射山东株细菌培养物,分2个隔离器饲养,观察14d。试验分组及攻毒情况见表2。根据中华人民共和国兽药典:对照组4/4发病,免疫组6/8保护;对照组3/4发病,免疫组7/8保护为合格。


1.14 水平传播试验 取60~90日龄SPF鸡20只,其中攻毒组6只,对照组14只,分别放入饲养面积相同的1、2号隔离器中饲养。每组鸡按要求各眶下窦内接种山东株细菌培养物或PBS,接种后逐日观察其临床表现。试验分组及攻毒情况见表3。
1.15 分离菌株血清型鉴定 将菌株用20%甘油保存,送匈牙利诗华研发中心鉴定其血清型。


1.16 序列测定与分析 从琼脂糖中回收PCR产物目的片段,用双脱氧法直接对PCR产物进行测序,为了保证序列准确性,同时反向测定序列加以验证。并将所测定的A 型副鸡嗜血杆菌(山东株)基因序列与NCBI基因库中参考株(GenBank登录号:DQ132874.1)相应序列进行比较分析。
2 结果
2.1 细菌分离及初步鉴定 从病鸡的眶下窦内共分离到1株可疑细菌,该菌株在含NAD的鸡血清琼脂平皿上呈露滴状生长;在普通肉汤和普通琼脂平皿上不生长。革兰氏染色为阴性短杆菌,两极浓染。过氧化氢酶试验结果为阴性。无菌检验结果显示,在TG、GA、GP上均无菌生长。
2.2 PCR反应结果 由图1可知,分离的可疑细菌与标准阳性对照菌在500bp处出现了大小相同的DNA条带,且与预期的扩增片段大小一致。

2.3 回归试验 用山东分离菌人工感染SPF鸡24h后均出现眶下窦及脸部严重肿胀、食欲减退、呆立、鼻孔有黏液流出等典型的IC临床发病症状。在感染鸡的眶下窦内又重新分离到了副鸡嗜血杆菌。接种PBS的对照鸡,至观察结束未出现IC发病症状。
2.4 免疫攻毒试验 根据中华人民共和国兽药典的判定原则可知,副鸡嗜血杆菌山东株的免疫攻毒试验结果显示,对照组3/4发病,免疫组8/8保护,结果表明,鸡传染性鼻炎(A 型)灭活疫苗对该分离菌株的保护为合格。
2.5 水平传播试验 1号隔离器中的攻毒组3/3发病,对照组至观察结束未见IC发病症状。2号隔离器中的攻毒组3/3发病,对照组在攻毒后第5天相继出现了流鼻涕,脸部肿胀、打喷嚏、食欲减退等IC发病迹象。随后对2号隔离器中对照组鸡进行细菌的分离培养及PCR检测鉴定,证明所分离到的菌株为副鸡嗜血杆菌。
2.6 血清型鉴定结果 分离到的Hpg经匈牙利诗华研发中心鉴定为A型副鸡嗜血杆菌。
2.7 序列测定与分析结果 经序列测定,克隆的PCR产物长度为488bp。应用DNAStar软件进行基因核苷酸序列遗传距离分析,结果显示,该基因序列与NCBI基因库中参考株(GenBank 登录号:DQ132874.1)相应序列同源性达到99.0%(图2)

3 讨论
本试验中,分离菌在含NAD的鸡血清琼脂平皿上呈露滴状生长,在普通肉汤和普通琼脂平皿上不生长;革兰氏染色为阴性短杆菌,两极浓染;过氧化氢酶试验结果为阴性;无菌检验显示在TG、GA、GP上均无菌生长;将分离菌人工感染SPF鸡24h后均出现眶下窦及脸部严重肿胀、食欲减退、呆立、鼻孔有黏液流出等典型的IC临床发病症状,同时在感染鸡的眶下窦内又重新分离到了副鸡嗜血杆菌;在PCR结果阳性的基础上,用已知Hpg A 型鼻炎灭活疫苗免疫SPF鸡后接种山东分离菌株可以达到100%(8/8)保护,证明所分离到的Hpg为A型;为了进一步验证分离物,将分离到的Hpg送匈牙利诗华研发中心代为鉴定,鉴定结果与攻毒保护试验结果一致,可以判定该分离物为A 型副鸡嗜血杆菌,暂命名为副鸡嗜血杆菌山东株。鸡传染性鼻炎的传播途径主要是通过飞沫及尘埃经呼吸道的水平传播,在传播试验中1号隔离器中饲养6只鸡,没有发生水平传播的现象,在同样面积的2号隔离器中饲养14只鸡,攻毒后第5天,接种PBS的对照鸡相继出现了发病迹象,后经实验室细菌分离鉴定为Hpg。此结果表明,造成Hpg的水平传播和IC的反复发作与饲养密度有很大的关系,这是在通风条件较好的隔离器中,如果在通风条件不达标,鸡舍寒冷潮湿或鸡舍内闷热,氨气浓度过大的大型养殖场内更容易造成Hpg传播,会直接影响到养殖户的经济效益。本试验对A 型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定与免疫攻毒试验及基因序列同源性比对分析结果,进一步验证了现阶段该鸡场所分离到的副鸡嗜血杆菌菌株没有发生变异,毒力没有增强的趋势,现有疫苗完全能够做到免疫保护。本试验分离到PCR阳性菌株经进一步分型鉴定及测序分析为A型副鸡嗜血杆菌(山东株),值得关注的是,另外8株PCR阴性的菌株虽然不是副鸡嗜血杆菌,但是否也会导致鸡传染性鼻炎症状的发生,有待于进一步研究。